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熒光壽命是熒光基團(tuán)在通過發(fā)射熒光光子返回基態(tài)之前在其激發(fā)態(tài)下保持平均多長時間的量度。不同熒光基團(tuán)激發(fā)態(tài)停時間不同，大多數(shù)生物熒光素的熒光壽命時間在 0.2 - 20 ns。

熒光壽命檢測經(jīng)典方法為點對點的時間相關(guān)單光子計數(shù)（TCSPC），但由于過去檢測硬件的局限和復(fù)雜的使用而沒有被廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究。

隨著技術(shù)的發(fā)展，在顯微鏡視野內(nèi)進(jìn)行*快速全像素?zé)晒鈮勖盘柌杉臒晒鈮勖上癯蔀榭赡堋?/p>

熒光壽命成像 VS 熒光強(qiáng)度成像

熒光壽命成像具有不同于熒光強(qiáng)度成像的眾多優(yōu)點：

不受染料濃度的影響
無論染色或免疫熒光的效率高或低，熒光壽命都能呈現(xiàn)一致的數(shù)據(jù)，這意味著更少的實驗數(shù)量和重復(fù)性更好的實驗結(jié)果。
不受光漂白的影響
熒光發(fā)射時間不受激發(fā)光強(qiáng)度的影響，因此不存在光漂白問題。
不受樣本厚度和光源噪聲的影響

熒光成像新維度

作為熒光成像中除光譜和強(qiáng)度之外的新維度，當(dāng)前，熒光壽命成像主要應(yīng)用領(lǐng)域包括：

用于樣品分離，如利用不同染料熒光壽命的差異將不同組織、正常與癌變細(xì)胞等有效分離。

△ 銀莓花萼的熒光壽命對比。熒光強(qiáng)度（視頻左窗口）無法區(qū)分的結(jié)構(gòu)在Fast-FLIM和壽命擬合圖像（視頻左、右窗口）中得以清晰明顯的區(qū)分。視頻后半部分顯示為壽命分離的三種成分（RGB）

△ 細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。綠色：Alexa Fluor 555- Vimentin，藍(lán)色：Alexa Fluor 546- tubulin。

熒光團(tuán)在光譜上非常相似（max 580 vs 573）無法分離，但它們在熒光壽命上差異明顯。原圖像：512 x 512 像素

揭示分子間相互作用，如利用FLIM-FRET研究蛋白-蛋白間相互作用。

△ 表達(dá) EPAC mT2-dVenus FRET探針的HeLa細(xì)胞中cAMP波動。EPAC對cAMP促進(jìn)劑 IBMX和Forskolin的響應(yīng)。成像條件：2 FPS，512 x 512 像素。彩色熒光壽命標(biāo)尺：ns

鳴謝：Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam

作為生物傳感器，如評價藥物/理化條件對細(xì)胞的影響、Ca+震蕩等。

△ 非生理條件（Ph 8.5）哺乳動物細(xì)胞自發(fā)熒光隨NAD/NADH的變化：表現(xiàn)為隨時間推移熒光壽命縮短、氧化應(yīng)激不斷增強(qiáng)。512 x 512 像素。彩色熒光壽命標(biāo)尺：ns

FLIM共聚焦顯微鏡：SP8 FALCON

熒光壽命成像完整解決方案

SP8 FALCON是徠卡*新的FLIM共聚焦顯微鏡，是真正意義上的熒光壽命成像完整解決方案。其FLIM成像速度是經(jīng)典TCSPC檢測系統(tǒng)的10倍，具有3D-FLIM、Time-lapse FLIM、大樣品FLIM圖像拼接等眾多采圖模式。此外，SP8 FALCON還可以與DIVE多光子成像、STED納米分辨率成像技術(shù)結(jié)合，充分拓展了壽光命成像的使用范圍，實現(xiàn)可相互驗證的多維度樣品成像。

對活體樣品的*快速熒光壽命成像和壽命對比，實現(xiàn)真正的生物動力學(xué)分析和功能成像！

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