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直到80年代末，大多數(shù)生命科學(xué)研究人員通過(guò)捕獲的各種細(xì)胞學(xué)特征單一的快照使用固定和染色（實(shí)際上，非生物）標(biāo)本研究生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜細(xì)節(jié)。在過(guò)去的幾十年中，然而，研究在生物和醫(yī)學(xué)科學(xué)已經(jīng)在很大程度上轉(zhuǎn)移重點(diǎn)調(diào)查了發(fā)生在生命系統(tǒng)的分子，細(xì)胞和整個(gè)生物體水平上的時(shí)間尺度范圍從毫秒到小時(shí)浩大的動(dòng)態(tài)過(guò)程。 此過(guò)渡到成像活細(xì)胞的司機(jī)已墊付的發(fā)展顯微儀器，更靈敏的數(shù)碼相機(jī)，以及新合成和基因編碼的熒光基團(tuán)，能夠針對(duì)特定的細(xì)胞器，精度高。 因此，單次顯微照片和固定的，死細(xì)胞數(shù)位影像時(shí)代使用寬合成的探針，量子點(diǎn)和熒光蛋白的光譜已經(jīng)在很大程度上屈從于活細(xì)胞成像，其中重點(diǎn)在顯微鏡載物臺(tái)上保持細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間的時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵因素。

在透射光及熒光顯微鏡活細(xì)胞時(shí)移成像技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越普遍也許是*好的，幾乎出現(xiàn)在科學(xué)文獻(xiàn)中，每天的研究報(bào)告數(shù)量浩繁證明。 在大多數(shù)情況下，細(xì)胞活性在專(zhuān)門(mén)為使用熒光探針技術(shù)聯(lián)接到連續(xù)的圖像捕獲顯微鏡載物臺(tái)設(shè)計(jì)的組織培養(yǎng)成像室監(jiān)測(cè)。 *的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)，如微分干涉對(duì)比（DIC），相位對(duì)比，暗視野，熒光，和霍夫曼調(diào)制反差（HMC）可以采用用于記錄的動(dòng)態(tài)在寬的試樣如以上冗長(zhǎng)的時(shí)間周期連續(xù)序列的頻譜。 同樣的，更*的熒光技術(shù)，包括激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤(pán)，多光子，和全內(nèi)反射（TIRF）顯微鏡越來(lái)越多地被用于隨時(shí)間監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)程。

除了其在細(xì)胞生物學(xué)重要性，延時(shí)成像，也可用于研究多種液體樣品和固體材料在化學(xué)，工業(yè)，和地質(zhì)系統(tǒng)，以及液晶相轉(zhuǎn)變和結(jié)構(gòu)分析的光譜新的和*材料金相。 在基礎(chǔ)生命科學(xué)，時(shí)間推移成像（也稱(chēng)為cinemicrography）已被證明是一種有效的工具，調(diào)查粒子運(yùn)動(dòng)，分子間的相互作用，細(xì)胞遷移，細(xì)胞分裂，細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞凋亡，分化和神經(jīng)生長(zhǎng)過(guò)程中，其中一個(gè)許多新的和有前途的應(yīng)用。 *近，在熒光蛋白質(zhì)跨越整個(gè)可見(jiàn)光譜的發(fā)展**已導(dǎo)致只能通過(guò)觀察隨著時(shí)間的推移進(jìn)行調(diào)查動(dòng)態(tài)無(wú)數(shù)細(xì)胞內(nèi)事件的發(fā)現(xiàn)。

示于圖1是一些在活細(xì)胞顯微術(shù)用于延時(shí)成像更加有用和流行的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)的例子。 在圖1所示的粘合印度麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞（一）進(jìn)行成像在DIC的方式來(lái)可視化細(xì)胞骨架的應(yīng)力纖維贅疣。 鼠袋鼠腎上皮細(xì)胞在圖1中相位對(duì)比成像（PTK1線(xiàn)）（B）揭示了從中止細(xì)胞分裂而產(chǎn)生的雙核細(xì)胞，而一個(gè)單獨(dú)的人骨肉瘤（U2OS線(xiàn)）細(xì)胞的成功的分割捕捉與HMC中圖1（c）。 這些**的透射光技術(shù)被廣泛用于時(shí)間推移活細(xì)胞成像。 同樣，激光掃描熒光技術(shù)和旋轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡（圖1（d）中，DEOS熒光蛋白在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞;在HeLa細(xì)胞和圖1（e）中，EGFP-標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）可被用于許多的觀察，包括光活化，共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），光漂白技術(shù)，運(yùn)動(dòng)性，以及熒光蛋白分布的動(dòng)力學(xué)。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM，圖2（f）中示出的mCherry熒光蛋白融合到紐蛋白在狐肺成纖維細(xì)胞）是用來(lái)觀察發(fā)生在靠近蓋玻片細(xì)胞膜的事件。

在時(shí)間推移成像的歷史透視

時(shí)間推移成像在活細(xì)胞中的應(yīng)用是由一個(gè)年輕的法國(guó)研究生誰(shuí)正在檢查活動(dòng)力梅毒螺旋體生產(chǎn)報(bào)在100多年前（大約五年前卓別林做了他的*部電影）。 學(xué)生，讓Comandon，用一個(gè)巨大的電影膠片相機(jī)連接到一個(gè)更小的暗視野顯微鏡，期間一個(gè)復(fù)雜的配置捕獲的圖像序列，但認(rèn)為很粗糙的現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)。 在后二十世紀(jì)上半葉，時(shí)間推移圖像序列采用緊湊型16毫米相機(jī)上配備相襯照明顯微鏡通常記錄。 連續(xù)的圖像捕獲之間的時(shí)間間隔是由粗大的輔助intervalometers，該裝置把燈打開(kāi)和關(guān)閉圖像之間，為了避免試樣的過(guò)度照射和加熱控制。用于電子顯微鏡光源百葉窗沒(méi)有市售，直到20世紀(jì)80年代。

依靠膠片相機(jī)的早期時(shí)間推移成像技術(shù)是受到眾多陷阱。 *重要的，這部電影不得不被發(fā)送出去（在大多數(shù)情況下）為商業(yè)處理，這意味著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估可以通過(guò)幾天甚至幾個(gè)星期被推遲。 此外，使用薄膜是昂貴的和受主的，通常導(dǎo)致不一致的結(jié)果的處理的變化。 例如，暴露的錯(cuò)誤可能不會(huì)發(fā)現(xiàn)，直到周的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，和焦點(diǎn)漂移的共同問(wèn)題是往往無(wú)法檢測(cè)，直到處理膜被查看。 雖然許多隨時(shí)間推移成像相關(guān)的文物，如焦點(diǎn)漂移，樣品不均勻加熱和震動(dòng)，仍采用現(xiàn)代數(shù)碼相機(jī)的時(shí)候妨礙*終結(jié)果，該技術(shù)已顯著成熟，在過(guò)去的十年。（本文來(lái)源：尼康顯微鏡在活細(xì)胞顯微術(shù)焦點(diǎn)漂移矯正）

發(fā)生在時(shí)間推移cinemicrography的*次重大進(jìn)步，當(dāng)視頻管攝像機(jī)和圖像采集卡電腦卡終于與顯微鏡結(jié)合，開(kāi)始在20世紀(jì)70年代。 雖然由視頻攝像機(jī)產(chǎn)生的圖像中較低的分辨率比傳統(tǒng)的基于乳液的膜，大約與膠片攝像機(jī)相關(guān)聯(lián)的曝光設(shè)置的不確定性都大大減少。 作為一個(gè)額外的好處，對(duì)圖像序列可以采集過(guò)程中進(jìn)行查看，并立即供審查和編輯使用錄像帶輸出延長(zhǎng)時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 相比之下，耦合到一個(gè)磁帶錄音機(jī)攝像機(jī)的成本是顯著小于膠片電影攝影機(jī)，當(dāng)膜處理的費(fèi)用被認(rèn)為是。 對(duì)于錄像帶與電影的重復(fù)費(fèi)用也少得多，而且含有不良序列磁帶可以被擦除或覆蓋，并置于重新投入生產(chǎn)。

活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的一個(gè)例子是使用photoconvertible 光學(xué)熒光筆熒光蛋白標(biāo)記的線(xiàn)粒體示于圖2。 試樣是一種附著兔腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)物（RK-13 行）表達(dá)融合的紅-綠photoconvertable DEOS熒光蛋白到線(xiàn)粒體靶向肽序列。 當(dāng)與488納米的激光照射，豐富的綠色熒光線(xiàn)粒體整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中（圖2（a））的觀察。 位于長(zhǎng)filopodium單個(gè)線(xiàn)粒體是使用從在*幀中的405納米激光的簡(jiǎn)要脈沖光轉(zhuǎn)換。 新紅色熒光的細(xì)胞器是一個(gè)20分鐘的間隔后捕獲為未轉(zhuǎn)換的線(xiàn)粒體途徑（圖2（b））。 片段化后，將未轉(zhuǎn)化的線(xiàn)粒體使一個(gè)接近的方法來(lái)光轉(zhuǎn)換鄰居（圖2（c）），并且這兩個(gè)線(xiàn)粒體隨后保險(xiǎn)絲（圖2（d））與細(xì)胞器之間分布的光轉(zhuǎn)換熒光蛋白標(biāo)記。 第二碎片事件（圖2（e））后，將光轉(zhuǎn)換線(xiàn)粒體的一小部分接近第二未轉(zhuǎn)化的線(xiàn)粒體，但不是熔化，形成了一個(gè)環(huán)形（圖2（f））。 在圖2所示的幀由包含在2小時(shí)內(nèi)收集到*過(guò)1000圖像的時(shí)移序列被選定。

盡管越來(lái)越多的研究正在成為使用熒光蛋白參與了活細(xì)胞時(shí)移序列采集，數(shù)字靜像繼續(xù)被廣泛地用于在延長(zhǎng)的時(shí)間周期記錄在細(xì)胞培養(yǎng)物中的動(dòng)態(tài)事件。 在許多情況下，間歇性單圖像可以以更高的分辨率使用照明水平大于都是可行的串行延時(shí)成像捕獲的具有改進(jìn)的信號(hào)與噪聲。然而，在計(jì)算機(jī)體系結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)容量技術(shù)的迅速發(fā)展也助推延時(shí)cinemicrography到復(fù)雜的一個(gè)新的水平。 在主內(nèi)存，快速緩存，處理器速度和硬盤(pán)容量上一個(gè)局限被克服，使包含數(shù)千幀的組成和幾個(gè)GB復(fù)雜的圖像序列，可以在本地存儲(chǔ)主機(jī)上。 硬件的進(jìn)步已通過(guò)并聯(lián)可控制幾乎所有方面的高速圖像采集，包括載物臺(tái)運(yùn)動(dòng)，光照強(qiáng)度，曝光時(shí)間（和其他的相機(jī)參數(shù)），輔助的光學(xué)元件（如放置DIC棱鏡在新的和復(fù)雜的軟件程序包光路）和波長(zhǎng)。 **的軟件也可以進(jìn)行采集后圖像處理，增強(qiáng)的視頻功能。 在簡(jiǎn)單的系統(tǒng)中，介質(zhì)的性能的計(jì)算機(jī)可使用通過(guò)一些接口來(lái)控制一個(gè)科學(xué)級(jí)的數(shù)碼相機(jī)。

在專(zhuān)門(mén)的熒光顯微鏡技術(shù)，包括激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤(pán)，TIRF和多光子耦合到新興的電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）技術(shù)，使科學(xué)家能夠觀察廣，利用新開(kāi)發(fā)的熒光動(dòng)力學(xué)事件的頻譜現(xiàn)代進(jìn)步探頭針對(duì)特定的細(xì)胞區(qū)室，生物分子和受體蛋白。 通過(guò)采用這種*的方法，多個(gè)事件可以同時(shí)記錄在四個(gè)或更多個(gè)尺寸（橫向，軸向，在時(shí)間上和光譜上）提供一種非侵入性的窗口進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的活性在一定時(shí)間范圍內(nèi)選定。 此外，活細(xì)胞成像技術(shù)已經(jīng)在幫助**目前在細(xì)胞生物學(xué)，這是提供具有空間和時(shí)間信息的科學(xué)家，這是以前沒(méi)有的。

焦點(diǎn)漂移的起源

盡管有各種各樣的，在過(guò)去的幾年里已經(jīng)發(fā)生了光學(xué)顯微鏡的技術(shù)進(jìn)步，通過(guò)緩慢的變化表現(xiàn)為標(biāo)本聚焦在時(shí)間推移成像過(guò)程中的軸向波動(dòng)仍然是一個(gè)顯著的問(wèn)題。 術(shù)語(yǔ)焦點(diǎn)的漂移通常是用來(lái)描述一個(gè)顯微鏡無(wú)法維持所選擇的焦平面在一段較長(zhǎng)的時(shí)間。 分別發(fā)生在活標(biāo)本的自然運(yùn)動(dòng)的這件神器，主要受一些影響因素，下面列出。 一般情況下，采用高放大倍率和數(shù)值孔徑油浸物鏡時(shí)（有重點(diǎn)的非常淺的景深）比它更低的放大倍率（10倍和20倍），與更廣泛的震源深度物鏡，重點(diǎn)漂移是更多的問(wèn)題。

• 熱漂移 -溫度的變化也許是焦點(diǎn)漂移的*常見(jiàn)來(lái)源。 波動(dòng)溫度所產(chǎn)生的空調(diào)和供熱單位在實(shí)驗(yàn)室中的結(jié)果，在顯微鏡激烈的照明光源，以及加熱不均的物鏡和階段通常是在焦點(diǎn)漂移的主要元兇。 此外，不同的膨脹和收縮率的材料用于構(gòu)成培養(yǎng)腔室和/或光學(xué)顯微鏡列車(chē)可導(dǎo)致距離的物鏡前透鏡與蓋玻片之間的變化，從而導(dǎo)致聚焦的損失。 具有*高倍率物鏡，只需1度的變化通常足以產(chǎn)生0.5至1.0微米的焦平面偏移。

• 蓋玻片的Flex -熱梯度和在培養(yǎng)室的溫度等變化，以及與灌注期間迫使流體通過(guò)所述成像室相關(guān)聯(lián)的工件，可以制作隔膜作用在該標(biāo)本彈離焦的蓋玻片彎曲。 這神器往往是顯而易見(jiàn)的內(nèi)庭，其中灌注系統(tǒng)控制不佳。 蓋玻片彎曲可能不會(huì)在圖像捕獲序列可以灌注會(huì)話(huà)之間是交錯(cuò)的情況下，呈現(xiàn)顯著的問(wèn)題，但它會(huì)嚴(yán)重影響那些需要較高的時(shí)間分辨率（2秒或更少）的研究。 蓋玻片撓曲可以通過(guò)減少在流動(dòng)室的灌注輸入口的直徑，并通過(guò)裝備在顯微鏡用物鏡加熱器以補(bǔ)償腔室的溫度波動(dòng)*小化。 小，但可再現(xiàn)的，在蓋玻片的運(yùn)動(dòng)也可以發(fā)生在培養(yǎng)室，均設(shè)有導(dǎo)電性，透明涂層，以維持溫度。 在這種情況下，施加的電流負(fù)載，以涂布的蓋玻片上可以產(chǎn)生收縮或暫時(shí)打亂焦點(diǎn)擴(kuò)展。 正確的焦平面通常將重新建立一次電流負(fù)載被刪除。

• 成像室加熱的不均勻性 -活細(xì)胞成像腔室產(chǎn)生的各種各樣的配置，往往利用不同的技術(shù)用于保持試樣在恒定溫度。 例如，腔室具有被加熱的導(dǎo)電涂層（圖3（a））的蓋玻片往往產(chǎn)生在整個(gè)玻璃表面優(yōu)異的導(dǎo)熱一致性比這樣做只加熱周?chē)纳w玻片的周?chē)慕饘偾弧?/span> 在后者的情況下的熱梯度可以很大（圖3（b））。 此外，高的數(shù)值孔徑的油或水浸物鏡可以作為一個(gè)散熱器，以傳導(dǎo)熱量遠(yuǎn)離所述試樣腔室和進(jìn)金屬物鏡，這樣就產(chǎn)生在液浸介質(zhì)中的區(qū)域中的熱梯度。 其他文物，如從電源并在室溫顯著波動(dòng)電流的變化也可以負(fù)責(zé)在樣品室加熱違規(guī)行為。

• 振動(dòng) -一種常見(jiàn)的神器與眾多的起源，振動(dòng)往往是由多種與儀器配置有關(guān)，此外就是出現(xiàn)在周?chē)沫h(huán)境資源要素的生產(chǎn)。 在顯微鏡及配件，過(guò)濾器車(chē)輪，百葉窗，自動(dòng)階段，過(guò)濾器的炮塔，和零部件等機(jī)電運(yùn)動(dòng)是振動(dòng)與穩(wěn)定的重點(diǎn)干擾的常見(jiàn)原因。常見(jiàn)的外部（非顯微鏡）的振動(dòng)源是空氣處理系統(tǒng)，步行交通，冰箱壓縮機(jī)，電梯，并且成像設(shè)置近重型設(shè)備的議案。 隔離表，減震墊，以及臺(tái)式平臺(tái)上，可從各種各樣的分銷(xiāo)商的，是有用的，以減少振動(dòng)。

• 機(jī)械不穩(wěn)定性 -滿(mǎn)載物鏡的一個(gè)物鏡轉(zhuǎn)換器可以在3和5英鎊，這往往代表對(duì)涉及顯微鏡對(duì)焦機(jī)構(gòu)的機(jī)械組件的顯著重力應(yīng)變之間的權(quán)衡。 其結(jié)果是，聚焦偏移的發(fā)生原因只是由于重力對(duì)物鏡轉(zhuǎn)換器的拉力。 此神器可以只使用一個(gè)單一的物鏡來(lái)記錄時(shí)間推移錄像可以減輕到一定程度。 此外，明智的做法是確保（如果可能），該顯微鏡配備有具有短長(zhǎng)度的機(jī)械精密聚焦系統(tǒng)，并維持聚焦張力控制的適當(dāng)?shù)脑O(shè)置。機(jī)械不穩(wěn)定性的其他來(lái)源包括松散的齒輪組中的焦點(diǎn)機(jī)架或聚光鏡支柱，以及作為輔助成分。

• 浸沒(méi)介質(zhì)波動(dòng) -在高分辨率活細(xì)胞研究，用于延時(shí)實(shí)驗(yàn)的顯微鏡物鏡可能需要包括油，水或甘油浸入介質(zhì)。 在過(guò)去的收集到足夠的數(shù)據(jù)，粘度波動(dòng)和成像介質(zhì)的化學(xué)分解所需的時(shí)間太久，會(huì)影響性能和浸泡媒體的傳播。 浸油的粘度和折射率通常隨溫度變化和水很容易蒸發(fā)，必須考慮和監(jiān)測(cè)，以避免焦點(diǎn)漂移的因素。 新開(kāi)發(fā)的高性能有機(jī)精油，可在大范圍內(nèi)的折射率（包括等同于水和甘油值），并提供了一個(gè)很好的解決方案，以使用傳統(tǒng)的浸入式媒體。 在某些情況下（取決于成像室配置），一個(gè)墊圈或套管可被用于形成物鏡和蓋玻片，以減少水蒸發(fā)的水平之間的密封。

• 加入試劑 -許多研究需要的培養(yǎng)基或添加化學(xué)試劑時(shí)延時(shí)成像序列變化。 導(dǎo)入試劑到培養(yǎng)室的物理行為可以產(chǎn)生機(jī)械沖擊，這將導(dǎo)致在焦點(diǎn)漂移和添加試劑不屬于在同一溫度作為成像介質(zhì)可以產(chǎn)生類(lèi)似的效果。 在加熱的灌注系統(tǒng)，引入新的媒體或化學(xué)品通常產(chǎn)生微不足道的變化的軸向聚焦平面，但用移液管或注射器中加入液體以一個(gè)開(kāi)放的腔室可以擾亂焦點(diǎn)。

• 橫向運(yùn)動(dòng)階段 -在某些情況下，房間的溫度波動(dòng)或振動(dòng)將產(chǎn)生一個(gè)小的橫向-機(jī)械階段，（在某些情況下）會(huì)導(dǎo)致軸向集中的漂移（x和y）的翻譯。 這通常是一個(gè)微不足道的問(wèn)題，但可以成為嚴(yán)重如果一個(gè)開(kāi)放導(dǎo)管的顯微鏡直接推動(dòng)冷或暖空氣。 如果該階段配備一個(gè)夾具，它應(yīng)該起延時(shí)成像之前被啟用，但在其他方面也有一些補(bǔ)救措施。 采用步進(jìn)電機(jī)*的顯微鏡階段一般不受到橫向移動(dòng)文物。

• 不安全的樣品室 -試樣成像室的延時(shí)序列中移動(dòng)會(huì)導(dǎo)致焦點(diǎn)漂移由于蓋玻片的新位置。 在固定玻璃底培養(yǎng)皿在載物臺(tái)光圈階段適配器，改變菜的位置可發(fā)生彎曲鉗或機(jī)械構(gòu)件，如干擾電線(xiàn)及氣/液管連接室控制器和其他的結(jié)果輔助元件。 此外，多井成像室往往從輕微變化放置時(shí)蒙受單獨(dú)蓋玻片連接到每個(gè)孔中，從而在掃描板聚焦誤差。 室運(yùn)動(dòng)和蓋玻片高度不一致是必須定期解決一個(gè)共同的神器。

• 標(biāo)本運(yùn)動(dòng) -在活細(xì)胞成像的一個(gè)不可避免的神器是試樣的運(yùn)動(dòng)遠(yuǎn)離顯微鏡焦平面。這通常使用正處于有絲分裂，其中的細(xì)胞顯著改變形狀的中期貼壁細(xì)胞采集時(shí)間推移順序發(fā)生時(shí)。 在其他情況下，試樣可以移出視場(chǎng)的，無(wú)論是通過(guò)從蓋玻片分離或通過(guò)蠕動(dòng)。 除了使用凝膠和試劑，如纖連蛋白錨定的細(xì)胞和組織的蓋玻片，沒(méi)有機(jī)械，化學(xué)，或?qū)z體的運(yùn)動(dòng)的電氣補(bǔ)償。

解決方案聚焦漂移

許多年來(lái)，用于校正焦點(diǎn)偏移的*佳解決方案是站，以便提供一個(gè)學(xué)生或技術(shù)員在顯微鏡近手動(dòng)重新聚焦在必要時(shí)。不幸的是，這是*不適合長(zhǎng)期成像實(shí)驗(yàn)相對(duì)成本過(guò)高以及基本無(wú)效的解決方案。焦點(diǎn)漂移的問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)各種渠道，包括軟件算法，專(zhuān)用顯微鏡硬件，抗振動(dòng)墊和表格，并封閉在保護(hù)環(huán)境的顯微鏡（如圖4）中得到解決。這些方法都得到不同程度的成功，但都沒(méi)有提供，可以擴(kuò)展到幾乎所有的活細(xì)胞成像場(chǎng)景焦點(diǎn)漂移的通用解決方案。

熱不穩(wěn)定性，這也許就是焦點(diǎn)漂移的*顯著源，可以在很大程度上是與大型有機(jī)玻璃外殼（稱(chēng)為消除環(huán)境試驗(yàn)箱 ;圖4（c）），從外部環(huán)境隔離的顯微鏡，并提供了良好的條件，促進(jìn)登錄相位細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)箱式外殼包圍顯微鏡載物臺(tái)，物鏡，熒光過(guò)濾器，以及透射光聚光，幾乎涵蓋整個(gè)顯微鏡以及試樣。這些室可用于各種培養(yǎng)容器，包括標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，載玻片與蓋玻片安裝及各種開(kāi)式和閉式成像室的。溫度保持與外部加熱裝置（通常是強(qiáng)迫空氣）和二氧化碳濃度被控制與耦合到由純氣體的氣瓶供給的調(diào)節(jié)器的感測(cè)單元。

環(huán)境試驗(yàn)箱還可以配備濕度控制及多種設(shè)計(jì)提供橡膠手套的訪(fǎng)問(wèn)，以避免在成像過(guò)程中操縱細(xì)胞，當(dāng)干擾環(huán)境的平衡。為了保持溫度控制程度高，避免焦點(diǎn)漂移，幾個(gè)比較成熟的孵化室括幾乎整個(gè)顯微鏡除外目鏡，攝像頭，并lamphouses的。在缺點(diǎn)方面，環(huán)境試驗(yàn)箱可以阻礙快速獲取標(biāo)本，并在繁瑣重復(fù)操作是必要的。此外，該室內(nèi)部的高濕度水平可以添加到保持在儀器由于齒輪潤(rùn)滑劑的過(guò)早降解和金屬表面和透鏡涂料氧化的費(fèi)用。作為替代，其耦合到階段頂孵化物鏡加熱器可以被使用，但這些裝置并不總是與具有保護(hù)桶，很難除去浸泡物鏡兼容。

在過(guò)去的幾十年中，眾多軟件算法已被設(shè)計(jì)來(lái)解決焦點(diǎn)漂移基于對(duì)比度或邊緣檢測(cè)。 許多這些*終被納入科學(xué)成像軟件包設(shè)計(jì)也處理圖像并控制顯微鏡。 焦點(diǎn)漂移的軟件控制需要被配備有數(shù)碼相機(jī)和計(jì)算機(jī)控制下的電動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器的顯微鏡。 通常情況下，重點(diǎn)調(diào)查基于軟件的顯微鏡需要兩個(gè)互補(bǔ)的算法來(lái)實(shí)現(xiàn)聚焦控制。 *確定了物鏡的軸向（z）的位置和真實(shí)的焦點(diǎn)之間的對(duì)應(yīng)。 第二個(gè)是一個(gè)搜索算法（圖5），通過(guò)捕獲圖像樣本的焦平面，以確定*大焦點(diǎn)“得分”的位置（*佳位置）。 大部分的重點(diǎn)軟件控制開(kāi)發(fā)的算法有，但是，在使用靜態(tài)的標(biāo)本具有穩(wěn)定的幾何結(jié)構(gòu)創(chuàng)建和當(dāng)時(shí)間推移調(diào)查適用于動(dòng)態(tài)活細(xì)胞是遠(yuǎn)不如有效。 此外，該算法通常用于特定照明場(chǎng)景（明場(chǎng)，相襯等）進(jìn)行優(yōu)化，并在應(yīng)用到對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)（如熒光），用于它們的目的不是可能失敗。

重點(diǎn)軟件算法通常依賴(lài)于一個(gè)良好的聚焦圖像包含比失焦圖像對(duì)比度更高或更精細(xì)的細(xì)節(jié)（實(shí)際上，更高的頻率）的事實(shí)。 作為一個(gè)例子，采用了拉普拉斯算子來(lái)估計(jì)焦點(diǎn)時(shí)，該算法計(jì)算出一個(gè)采樣圖像的二階空間導(dǎo)數(shù)，移動(dòng)物鏡向上或向下通過(guò)一個(gè)預(yù)先確定的量，然后重復(fù)該過(guò)程，直到*佳擬合被確定。 在分析過(guò)程中越來(lái)越小的步驟通常采取在兩個(gè)方向上。 從過(guò)濾器高輸出值表明大強(qiáng)度變化的區(qū)域，通常在圖像內(nèi)表示的邊緣。 在任何圖像，*高的頻率成分發(fā)生在邊緣，應(yīng)該是*突出的特點(diǎn)，當(dāng)試樣*佳聚焦。 為重點(diǎn)漂移，邊緣模糊，產(chǎn)生在圖像下二階導(dǎo)數(shù)。 采樣反復(fù)進(jìn)行，直至*合適的判定。 通常，這可能需要幾分鐘，這遇事推諉的軟件例程的重點(diǎn)只需要使用圖像采集間隔期長(zhǎng)的延時(shí)實(shí)驗(yàn)。

在共聚焦時(shí)間推移顯微鏡，其中每幅圖像保持清晰的對(duì)焦不論儀器是否正在經(jīng)歷軸向偏移，聚焦校正可以通過(guò)定期收集從樣品的一系列Z-堆棧（光學(xué)部分），不論厚度來(lái)實(shí)現(xiàn)。 單個(gè)堆疊然后分析使用軟件來(lái)確定在Z堆疊并且記錄在該序列的開(kāi)頭的參考圖像中的每個(gè)圖像之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。 堆棧分析后，具有像素強(qiáng)度的*大相關(guān)系數(shù)的圖像是用來(lái)識(shí)別正確的聚焦平面（對(duì)應(yīng)于基準(zhǔn)圖像的平面）。 協(xié)同定位信息可以被用來(lái)復(fù)位物鏡的焦平面。 雖然這種技術(shù)應(yīng)該工作得非常好提供的軟件和硬件接口正確，目前還沒(méi)有商業(yè)應(yīng)用。

從理論上講，使用軟件算法上的熒光標(biāo)本應(yīng)因明亮的熒光結(jié)構(gòu)和黑暗的背景之間有的對(duì)比度產(chǎn)生的效果。 然而在實(shí)踐中，基于軟件的補(bǔ)償技術(shù)要求是基于幾個(gè)圖像的熒光物種，從而導(dǎo)致光漂白和光毒性被加重與試樣的每個(gè)暴露于光效果的捕獲的計(jì)算。 此外，該算法是使用能產(chǎn)生清晰的聚焦光學(xué)部分，無(wú)論軸向焦點(diǎn)位置（如共聚焦，多光子，與DIC）的文書(shū)確定的重點(diǎn)幾乎無(wú)用。 使用軟件時(shí)，保持焦點(diǎn)另一個(gè)缺陷是，該算法往往能決定一個(gè)*佳的焦平面是從選定的時(shí)間推移序列的開(kāi)始的初始平面不同。 當(dāng)在軟件焦點(diǎn)判定的算法組合使用熒光，另一種是執(zhí)行用試驗(yàn)片的透射光圖像的焦點(diǎn)分析步驟。 然而，這需要機(jī)械快門(mén)的應(yīng)用兩個(gè)熒光和透射光路，可引入附加的振動(dòng)。

如圖6中所示要么是沒(méi)有任何焦點(diǎn)的漂移校正（圖6（a），6（b）和圖6（c））或具有基于硬件的焦點(diǎn)維護(hù)系統(tǒng)，如下面討論的（圖2進(jìn)行時(shí)移序列圖6（d），6（e）和6（f）段）。 該標(biāo)本是狐貍肺的文化（FoLu線(xiàn)）表達(dá)融合mPlum熒光蛋白和靶向序列產(chǎn)生明亮熒光的細(xì)胞器線(xiàn)粒體成纖維細(xì)胞。 圖像聚集在組合熒光和DIC的模式在一段7小時(shí)共聚焦顯微鏡工作在30秒的時(shí)間間隔。 如果沒(méi)有自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)，在顯微鏡很快失去焦點(diǎn)，就證明了熒光強(qiáng)度的圖6的連續(xù)虧損（b）和圖6（c），其中發(fā)生在不到45分鐘。 與此相反，硬件自動(dòng)對(duì)焦管理（通過(guò)圖6（六）圖6（d））為整個(gè)調(diào)查產(chǎn)生清晰，重點(diǎn)突出的圖像。

聚焦漂移補(bǔ)償系統(tǒng)

多年來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一系列旨在彌補(bǔ)焦點(diǎn)漂移的基于硬件的解決方案。 在大多數(shù)情況下，這些設(shè)備試圖測(cè)量，以保持試樣在焦點(diǎn)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的目的和樣品支架或臺(tái)之間的距離。 例如，附連到顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)換器的渦流傳感器的設(shè)計(jì)是由1發(fā)明人來(lái)監(jiān)視距離，以使用DC馬達(dá)耦合到所述聚焦機(jī)構(gòu)的階段和正確的波動(dòng)。 另一種技術(shù)采用的試樣保持器和連接到該物鏡，以提供用于支撐試樣夾持器的壓電元件的誤差信號(hào)的套環(huán)之間的距離依賴(lài)性的電容的優(yōu)點(diǎn)。 第三，更復(fù)雜的方法依賴(lài)于將一個(gè)全息光柵在物鏡瞳孔保持標(biāo)本的焦點(diǎn)。 專(zhuān)門(mén)的光柵產(chǎn)生由獨(dú)立的傳感器檢測(cè)，以產(chǎn)生聚焦校正信號(hào)的兩個(gè)散焦的一階圖像。 *后，一個(gè)前體到現(xiàn)代的硬件解決方案的結(jié)合在背反射被引導(dǎo)到一個(gè)小的棱鏡置于光學(xué)火車(chē)和監(jiān)視用雙光電二極管陣列，離軸氦 - 氖激光束的焦點(diǎn)依賴(lài)性變化。 在焦點(diǎn)自******移被檢測(cè)為一個(gè)非零差分信號(hào)，然后被用于驅(qū)動(dòng)一個(gè)簡(jiǎn)單的馬達(dá)連接到所述細(xì)焦點(diǎn)的機(jī)制。 雖然這些硬件焦點(diǎn)補(bǔ)償方案是成功的程度不同，沒(méi)有看到在商業(yè)顯微鏡系統(tǒng)的責(zé)任。

作為一個(gè)通用的方法來(lái)提高顯微鏡焦點(diǎn)的穩(wěn)定性，各廠(chǎng)商紛紛花費(fèi)相當(dāng)大的精力來(lái)產(chǎn)生的工程改進(jìn)，降低了重心偏移到*低限度。 例如，幾個(gè)嵌入式機(jī)械系統(tǒng)（重點(diǎn)組件，百葉窗，電動(dòng)平臺(tái)，炮塔旋轉(zhuǎn)）進(jìn)行了改進(jìn)和問(wèn)題的重型物鏡得到解決。 儀器的幀正在制作與專(zhuān)門(mén)的合金能夠抵抗熱膨脹，而輔助部件，如鼻甲正在與耐熱的聚合物制成。 這樣的改進(jìn)已經(jīng)加上*的線(xiàn)性編碼器，它是電動(dòng)的組件，可以重新定位階段或物鏡轉(zhuǎn)換器的精確位置用比50納米的精度。 盡管這些改進(jìn)已導(dǎo)致高級(jí)顯微鏡，可以一個(gè)或2微米內(nèi)保持聚焦更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，它們?nèi)匀灰恢睙o(wú)法克服的事實(shí)，加熱樣品室（和其相關(guān)聯(lián)的蓋玻片）受到熱膨脹和收縮，通往回到原來(lái)的焦點(diǎn)漂移的問(wèn)題。

為了解決固有的幾乎所有蓋玻片為基礎(chǔ)的成像腔熱漂移的文物，在顯微鏡和售后市場(chǎng)的制造商*近推出了新的硬件解決方案，通過(guò)采用幾種稍有不同，但仍密切相關(guān)的方法來(lái)彌補(bǔ)焦點(diǎn)漂移。 要注意的重要一點(diǎn)是，與浸沒(méi)物鏡，大多數(shù)這些裝置的操作基于這樣的假設(shè)下觀察和蓋玻片的水性表面的試樣之間的關(guān)系是固定的（因此，該細(xì)胞或組織薄不自由浮動(dòng)在培養(yǎng)液中）。 相反，細(xì)胞或組織（如黑腹果蠅卵室）或者是自然附著在玻璃或附加到通過(guò)薄的層粘連蛋白，纖連蛋白，多聚賴(lài)氨酸，或糖蛋白的蓋玻片。 所有市售系統(tǒng)的定位的上外部蓋玻片表面，通過(guò)測(cè)量由弱近紅外線(xiàn)激光或發(fā)光二極管（LED發(fā)出的反射光的形狀的線(xiàn)圖案的位置（玻璃和組織培養(yǎng)基或緩沖液之間的界面）;如示于圖7）。 相反，對(duì)于干物鏡，光從下部蓋玻片表面（與空氣接觸）的反射被用來(lái)確定樣品是否在焦點(diǎn)上。

該圖在圖7中的圖表呈現(xiàn)的重點(diǎn)漂移補(bǔ)償系統(tǒng)如何能夠利用光的反射的優(yōu)勢(shì)從蓋玻片來(lái)衡量的相對(duì)焦點(diǎn)位置。 的試樣中的感興趣區(qū)域是用于由操作者來(lái)設(shè)定初始從蓋玻片上表面，其中確定焦平面，并作為基礎(chǔ)補(bǔ)償（圖7（a））的偏移量。 當(dāng)焦點(diǎn)發(fā)生漂移（在此，作為蓋玻片更接近物鏡的軸向運(yùn)動(dòng)的結(jié)果，圖7（b）），激光二極管或反射從蓋玻片的檢測(cè)強(qiáng)度為重新定位物鏡和恢復(fù)所需的信息的偏移補(bǔ)償。 因此，電動(dòng)軸向聚焦單元接收反饋的補(bǔ)償制度，以糾正在蓋玻片檢測(cè)到的漂移，然后恢復(fù)偏移預(yù)定義的軸向值，樣品（圖7（c）和7（D提供清晰聚焦） ）。 注意，試樣本身不參與焦點(diǎn)校正，而通過(guò)反射在玻璃 - 水界面產(chǎn)生的干涉圖案控制這些設(shè)備。

總之，解決焦點(diǎn)漂移的問(wèn)題也許是發(fā)生在*近的歷史是活細(xì)胞成像的*顯著進(jìn)步。此工件必須總是設(shè)計(jì)為延時(shí)成像和更為明顯使用高數(shù)值孔徑物鏡，其中聚焦的窄深度可以很容易地與絲毫振動(dòng)移位或改變溫度時(shí)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)中加以解決。焦點(diǎn)漂移也是一個(gè)關(guān)鍵因素（還有一個(gè)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)）在每個(gè)時(shí)間間隔成像單個(gè)樣本中的橫向和軸向位置的復(fù)雜序列時(shí)消除。在大多數(shù)情況下，新的焦點(diǎn)漂移補(bǔ)償可以從顯微鏡制造系統(tǒng)能夠以不同的速度的情況下提供優(yōu)異的校正，雖然。不管復(fù)雜的儀器水平，然而，進(jìn)行延時(shí)實(shí)驗(yàn)與活細(xì)胞時(shí)，必須密切關(guān)注支付給上述漂移因素，包括熱環(huán)境，標(biāo)本成像室，振動(dòng)，浸入式媒體，穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性。一旦所有的基本細(xì)節(jié)已經(jīng)解決，謹(jǐn)慎的調(diào)查人員應(yīng)給予獎(jiǎng)勵(lì)以?xún)?yōu)異的成績(jī)。