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尼康顯微鏡的熒光激發(fā)塊

2023年02月21日 15:08:13      來源:奧林巴斯顯微鏡 >> 進(jìn)入該公司展臺      閱讀量:15

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在這里我們展示如何激發(fā)塊選擇的平場免疫熒光顯微鏡可以擴(kuò)展他們的能力。

平場免疫熒光顯微鏡是什么

熒光團(tuán)

熒光現(xiàn)象發(fā)生時(shí)由一種物質(zhì),當(dāng)它釋放能量,當(dāng)它從興奮狀態(tài)返回到其基態(tài)時(shí)就會發(fā)出亮光吸收特定波長的光 (勵(lì)磁光)。許多熒光物質(zhì) (稱為熒光團(tuán)) 已經(jīng)有不同的用途,與激發(fā)波長從紫外到紅外。然而,發(fā)射波長通常比的長的激發(fā)能量,使得它們的波長。

平場免疫熒光顯微鏡

平場免疫熒光顯微術(shù)指的是旨在觀察上述熒光團(tuán)的顯微鏡。光學(xué)系統(tǒng)包含一個(gè)光源為勵(lì)磁 (通常汞燈) 和一個(gè)激發(fā)塊來分開熒光激發(fā)光。有許多激發(fā)塊供不同種類的熒光團(tuán),可能會切換為連續(xù)查看標(biāo)本沾有多種類型的熒光團(tuán)的任何時(shí)間。

平場免疫熒光顯微鏡中的激發(fā)塊中的作用

如圖 1 所示,2 種類型的激發(fā)快和 1 二色鏡的構(gòu)建激發(fā)塊。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)塊和每次使用鏡子使得研究人員能夠達(dá)到一個(gè)高的信號信噪比 (S/N) 比之間的熒光和背景光。下文介紹了這些光學(xué)元件的功能。

勵(lì)磁激發(fā)塊 (EX)

勵(lì)磁激發(fā)塊是將只有激發(fā)光所需的波長從激發(fā)光源 (通常汞燈) 傳遞到熒光基團(tuán)的光元素。如圖 2 所示,只有激發(fā)波長通過激發(fā)塊,通常"帶通激發(fā)塊"。

二色鏡 (DM)

二色鏡是分開的熒光激發(fā)光光學(xué)元件。二色鏡是光的特殊的鏡子,反映只有一個(gè)特定波長,允許所有其他波長的光線通過 (圖 3)。在平場免疫熒光顯微鏡激發(fā)塊中使用的分色鏡放置在 45 ° 入射角,輕,創(chuàng)建一個(gè)"停止帶"的"及格樂隊(duì)"的傳輸?shù)墓夂头瓷涞墓狻?/span>光通過勵(lì)磁激發(fā)塊被反映 90 ° 朝著這一目標(biāo)和標(biāo)本。*后,從試樣所產(chǎn)生的光是通過傳遞和朝向觀察者 (或高靈敏度相機(jī))。

屏障激發(fā)塊 (BA) 或排放 (EM) 的激發(fā)塊

障礙激發(fā)塊分離產(chǎn)生的從其他背景光熒光的熒光的光學(xué)元件。如圖 4 所示,屏障激發(fā)塊傳輸阻塞所有其他輕微泄漏從 (反映從標(biāo)本或光學(xué)元件) 的激勵(lì)燈同時(shí)穿過二色鏡熒光波長的光。這是必要的因?yàn)闊晒夤獾膹?qiáng)度是比*過 100,光靠一個(gè)因素的激勵(lì)弱 000:1。大多數(shù)障礙激發(fā)塊被放置在一個(gè)小的角度,以允許更好的熒光成像通過抑制鬼魂形象。

尼康的噪音

尼康的平場免疫熒光顯微鏡都有一種專有的稱為"噪音"的尼康光學(xué)元件 (模型 TE2000 及更高版本)。如圖 1 所示,噪音允許高效加工的光通過二色鏡傳輸通過防止光線從激發(fā)塊內(nèi)散射和漏入的觀測圖像激發(fā)。這有助于消除背景光噪聲和更有效的熒光圖像。

選擇熒光激發(fā)塊和鏡

選擇熒光激發(fā)塊和鏡子時(shí),應(yīng)遵循以下步驟。

(熒光物質(zhì)) 熒光波長

確定在使用熒光的波長。此信息指出在目錄里,但熒光的波長特性也略有改變不同鹽度、 ph 值和胞內(nèi)條件等的可解條件。因此,我們建議用熒光計(jì)測量勵(lì)磁和熒光波長。然后,使用此信息來選擇*適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)元件。

二色鏡的選擇

所選色鏡必須有效分離激發(fā)光和熒光光的波長。具體而言,其透光率截止位于 fluophore 的激發(fā)波長和其熒光波長之間二色鏡必須通過比較鏡子的特性曲線與熒光的波長,鏡子放在 45 ° 入射角時(shí)發(fā)現(xiàn)。
如果 fluophore 的激發(fā)波長和其熒光波長關(guān)系密切,斯托克城的轉(zhuǎn)變 (注 1) 是小,然后應(yīng)選擇鏡像與更小的截止波長,讓盡可能多的熒光信號,通過盡可能。

障礙激發(fā)塊選擇

選擇一個(gè)激發(fā)塊,允許熒光波長從傳遞的標(biāo)本。通常情況下,長時(shí)間傳輸波長長的通激發(fā)塊都是選擇帶通激發(fā)塊。然而,是不會傳染這些波長較長的帶通激發(fā)塊是經(jīng)常用作屏障激發(fā)塊從一個(gè)多重染色標(biāo)本中分離的波長或使用相機(jī)對較長的波長敏感時(shí)。

勵(lì)磁激發(fā)塊選擇

選擇一個(gè)激發(fā)塊,允許激發(fā)波長下,順利通過。尤其是當(dāng)汞燈用作光源,有效的激勵(lì)被通過線譜的汞燈納入波長。允許之外的目標(biāo)熒光傳遞激發(fā)波長的波長將既增加背景光和損害標(biāo)本。如圖 7 所示,激勵(lì)效率較低的波長為 440 牛米。

  • 組合的屏障激發(fā)塊和勵(lì)磁激發(fā)塊

    障礙激發(fā)塊和激發(fā)塊勵(lì)磁的**結(jié)合是一個(gè)可以讓沒有光通結(jié)合時(shí)。發(fā)射的熒光是很弱,所以通過激發(fā)塊泄漏任何光線會降低圖像質(zhì)量。

    獲得明亮的熒光圖像

    有時(shí)它被建議刪除 ND激發(fā)塊在勵(lì)磁光學(xué)和增加激發(fā)光源的強(qiáng)度。然而,增加激發(fā)光源的強(qiáng)度將會快速漂白熒光基團(tuán),損害的標(biāo)本,以及日益增加的自體熒光 (注 2) 的單元格中。基于這些原因,光源應(yīng)保持盡可能弱和觀察光學(xué)作出盡可能高效在撿的熒光信號 (通過擴(kuò)大物鏡的孔徑,增加波段內(nèi)熒光濾光片,使用更加靈敏的照相機(jī)等)。。

  • [注 1]斯托克城的轉(zhuǎn)變是指激發(fā)能量和熒光能量所產(chǎn)生的能量部分損失作為熱作為電子落回從興奮狀態(tài)中熒光材料其基態(tài)之間的能量差。(從巖波書店書店的物理和化學(xué)詞典)

  • [注 2]自體熒光是指在非那些通常被定義為熒光物質(zhì)的熒光物質(zhì)的存在。例如,單元組件 (如 NAADPH 或核黃素給掉在短波長范圍內(nèi) (紫外和可見) 在不染色細(xì)胞相對較強(qiáng)的熒光。

還原漂白工藝

你可以采取以下步驟,以減少漂白。

使用抗漂白的代理

P-苯二胺抗漂白劑可以用于 FITC 和 n-丙基 gallete 可以用于羅丹明。

使用 ND 濾鏡

使用中性密度或 ND 濾鏡上顯微鏡以減少光的水平到*起碼的觀察。有時(shí)這可能需要設(shè)置的篩選到 99%,同時(shí)考慮不分割的光路步驟盡可能多。

使用漂白耐熒光

為每個(gè)測試的目的使用可用的*耐漂白劑熒光。



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