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在這里我們展示如何激發(fā)塊選擇的平場免疫熒光顯微鏡可以擴(kuò)展他們的能力。
熒光現(xiàn)象發(fā)生時(shí)由一種物質(zhì),當(dāng)它釋放能量,當(dāng)它從興奮狀態(tài)返回到其基態(tài)時(shí)就會發(fā)出亮光吸收特定波長的光 (勵(lì)磁光)。許多熒光物質(zhì) (稱為熒光團(tuán)) 已經(jīng)有不同的用途,與激發(fā)波長從紫外到紅外。然而,發(fā)射波長通常比的長的激發(fā)能量,使得它們的波長。
平場免疫熒光顯微術(shù)指的是旨在觀察上述熒光團(tuán)的顯微鏡。光學(xué)系統(tǒng)包含一個(gè)光源為勵(lì)磁 (通常汞燈) 和一個(gè)激發(fā)塊來分開熒光激發(fā)光。有許多激發(fā)塊供不同種類的熒光團(tuán),可能會切換為連續(xù)查看標(biāo)本沾有多種類型的熒光團(tuán)的任何時(shí)間。
選擇熒光激發(fā)塊和鏡子時(shí),應(yīng)遵循以下步驟。
確定在使用熒光的波長。此信息指出在目錄里,但熒光的波長特性也略有改變不同鹽度、 ph 值和胞內(nèi)條件等的可解條件。因此,我們建議用熒光計(jì)測量勵(lì)磁和熒光波長。然后,使用此信息來選擇*適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)元件。
選擇一個(gè)激發(fā)塊,允許熒光波長從傳遞的標(biāo)本。通常情況下,長時(shí)間傳輸波長長的通激發(fā)塊都是選擇帶通激發(fā)塊。然而,是不會傳染這些波長較長的帶通激發(fā)塊是經(jīng)常用作屏障激發(fā)塊從一個(gè)多重染色標(biāo)本中分離的波長或使用相機(jī)對較長的波長敏感時(shí)。
障礙激發(fā)塊和激發(fā)塊勵(lì)磁的**結(jié)合是一個(gè)可以讓沒有光通結(jié)合時(shí)。發(fā)射的熒光是很弱,所以通過激發(fā)塊泄漏任何光線會降低圖像質(zhì)量。
有時(shí)它被建議刪除 ND激發(fā)塊在勵(lì)磁光學(xué)和增加激發(fā)光源的強(qiáng)度。然而,增加激發(fā)光源的強(qiáng)度將會快速漂白熒光基團(tuán),損害的標(biāo)本,以及日益增加的自體熒光 (注 2) 的單元格中。基于這些原因,光源應(yīng)保持盡可能弱和觀察光學(xué)作出盡可能高效在撿的熒光信號 (通過擴(kuò)大物鏡的孔徑,增加波段內(nèi)熒光濾光片,使用更加靈敏的照相機(jī)等)。。
[注 1]斯托克城的轉(zhuǎn)變是指激發(fā)能量和熒光能量所產(chǎn)生的能量部分損失作為熱作為電子落回從興奮狀態(tài)中熒光材料其基態(tài)之間的能量差。(從巖波書店書店的物理和化學(xué)詞典)
[注 2]自體熒光是指在非那些通常被定義為熒光物質(zhì)的熒光物質(zhì)的存在。例如,單元組件 (如 NAADPH 或核黃素給掉在短波長范圍內(nèi) (紫外和可見) 在不染色細(xì)胞相對較強(qiáng)的熒光。
你可以采取以下步驟,以減少漂白。
P-苯二胺抗漂白劑可以用于 FITC 和 n-丙基 gallete 可以用于羅丹明。
使用中性密度或 ND 濾鏡上顯微鏡以減少光的水平到*起碼的觀察。有時(shí)這可能需要設(shè)置的篩選到 99%,同時(shí)考慮不分割的光路步驟盡可能多。
為每個(gè)測試的目的使用可用的*耐漂白劑熒光。