1前言1.1研究目的和意義高血壓是一種常見的心腦血管疾病，會(huì)引起心血管、大腦、腎臟的病變
[1]。降壓肽是一種ACE抑制劑，通常用于高血壓患者的治療
[2]。目前，對(duì)高血壓患者的治療通常使用化學(xué)合成的藥物，然而，這些合成藥物有一些副作用,包括咳嗽和皮疹
[3]。食源性降壓肽來源于天然植物，，易被人體吸收
[4]。不同的植物來源，降壓功效作用也是不同的。
核桃 (核桃) 蛋白質(zhì)的具有廣闊應(yīng)用前景的新產(chǎn)品和強(qiáng)化身體的好來源
[5]。核桃粕是核桃經(jīng)過提取油后的副產(chǎn)物，含有29.65%蛋白質(zhì)，提油后的核桃粕多數(shù)被用作飼料，資源造成了一定的浪費(fèi)，酶解核桃粕蛋白制備降壓肽可以促進(jìn)核桃粕的深加工，實(shí)現(xiàn)資源的綜合利用。本文采用兩種不同的蛋白酶共同作用水解蛋白，采用雙酶復(fù)合水解可以增加蛋白酶的特異性催化位點(diǎn)
[6]，可以提高可溶性蛋白含量及功能性多肽的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率
[7]，并且增大了蛋白的水解度，也一定程度上增大了蛋白原料對(duì)肽的轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而可以改善蛋白質(zhì)水解液中功能性多肽的特性。本實(shí)驗(yàn)將兩種蛋白酶分兩步進(jìn)行酶解，全面研究雙酶分步酶解工藝制備核桃粕降壓活性肽的工藝及參數(shù)，然后用響應(yīng)面法對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化。
1.2降壓肽的研究進(jìn)展日本是對(duì)食源性降血壓肽研究**多的**家，且已經(jīng)有此類降血壓肽的商品上市，以其天然無毒的特性受到了廣大消費(fèi)者的信賴，而我**在此項(xiàng)的研究才剛剛起步
[8]，目前臨床上的高血壓的藥物治療盡管有效可是也存在弊端，如降壓過度、泌尿系統(tǒng)發(fā)生病變、持續(xù)性咳嗽、味覺失真和血管神經(jīng)性水腫等，而通過蛋白酶的水解獲得的具有降血壓活性的多肽不僅可以對(duì)高血壓患者起到降血壓的作用，對(duì)身體體質(zhì)沒什么影響，適合患者長期服用。隨著**民生活水平的提高，人們的自我保健意識(shí)和安全意識(shí)也在逐漸加強(qiáng)，這種降血壓肽會(huì)逐漸被人們接受，成為預(yù)防，緩解和治療高血壓的一個(gè)有效手段。
2 材料與方法2.1 材料和設(shè)備核桃粕，康福壽核桃油加工有限公司；2709堿性蛋白酶(Alcalase)購于北京博奧拓達(dá)科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶購于sigma公司；FAPGG，呋喃丙烯酰三肽，購于sigma公司；ACE，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，購于sigma公司；正己烷、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉等均為分析純。試驗(yàn)用水均為去離子水。
快速恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-3 C雷磁pH計(jì) 上海精科；BS 2000 S電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；ELx 808酶標(biāo)儀 Thermo公司；SH 21-1磁力攪拌器 上海梅穎浦儀表制造有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
2.2 工藝流程低溫脫脂核桃粕→過60目篩→脫脂→提取核桃蛋白→堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶聯(lián)合酶解條件的優(yōu)化→核桃ACE抑制肽
2.3 核桃脫脂粉的制備核桃粕經(jīng)粉碎后過60目篩，用正己烷以1:5(w/v)的料液比在磁力攪拌器上提取1h后進(jìn)行抽濾，取濾渣重復(fù)用正己烷提取**濾液無色透明時(shí)收集濾渣，然后用恒溫干燥箱烘干溶劑，置于冰箱4℃冷藏備用。
2.4 核桃蛋白的提取采用堿溶酸沉法提取核桃蛋白。參照毛曉英
[9]的方法，略改。以購買的核桃脫脂粕為原料，將其烘干后粉碎，然后通過95%醇洗(1:10,(w/v))，過濾，把濾餅置恒溫干燥箱烘干溶劑。然后用去離子水配制蛋白質(zhì)溶液(1:26,(w/v))，調(diào)節(jié)蛋白液的pH值到11.0，置磁力攪拌器上53℃攪拌1.5h后7000r/min 25℃離心15min，取上清液，調(diào)節(jié)pH**4.5，攪拌1h，7000r/min 25℃離心15min，水洗沉淀，調(diào)節(jié)pH**中性后凍干，置于冰箱4℃冷藏備用。
2.5 水解蛋白酶的篩選表1 四種商業(yè)酶**適作用條件和酶活力
Table 1 The optimum hydrolysis conditions and the enzymatic activity of four commercial enzymes
| 酶種類 | **適pH | **適溫度(℃) | 酶活力(U/g) |
| 堿性蛋白酶 | 8.5 | 55 | 7.1×104 |
| 7.0 | 40 | 6.3×105 |
| 風(fēng)味蛋白酶 | 6.5 | 50 | 2.0×104 |
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