摘 要：目的：研究綠色熒光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)。方法：通過(guò)分別將DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取質(zhì)粒、酶切并連接形成重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化,通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶Not I與Bam H1和PCR對(duì)所建質(zhì)粒進(jìn)行分析鑒定后, 通過(guò)轉(zhuǎn)化的方法把含綠色熒光蛋白（GFP）外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體BL-21內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，再用IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達(dá)，可以看到顯現(xiàn)綠色，判斷GFP基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。 結(jié)果：結(jié)果顯示構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-GFP在E.coli中成功表達(dá)。
**詞：綠色熒光蛋白；質(zhì)粒重組；原核表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)
中圖分類號(hào)：Q53
Studies On Cloning and Expression of Green Fluorescent Protein gene
Abstract: Objective:Studies indicated that the cloning and expression of the GFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N3) and DH-5α (pET-28a). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pET-28a-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR transfected into E.coli DH-5α to ensure the expression of green fluorescent protein. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of GFP into E.coli for expression, through transformative method. The expression of GFP gene can be induced by the IPTG and then we can see green. Results: The results suggest that pET-28a-GFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli.
Keywords: Ged Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression
綠色熒光蛋白的基因克隆和表達(dá)的研究
引言
隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用, 人們根據(jù)自己的意愿有目的、有計(jì)劃、有根據(jù)、有預(yù)見(jiàn)地將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi), 使外源基因進(jìn)行表達(dá)、闡明基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理或者通過(guò)與染色體基因組進(jìn)行穩(wěn)定整合，將生物性狀傳遞給子代動(dòng)物的研究方興未艾
[1]。
基因標(biāo)記技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)。熒光蛋白基因在標(biāo)記基因方面由于具有的優(yōu)點(diǎn)而引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注，現(xiàn)已被普遍應(yīng)用到分子生物學(xué)研究的各個(gè)方面。熒光蛋白是海洋生物體內(nèi)的一類發(fā)光蛋白，分為綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白
[2]。
2008 年10 月8 日，瑞典**把今年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者和推廣者。他們分別為日本科學(xué)家下村修(Osamu Shimomura)、美**科學(xué)家馬丁·查爾菲(Martin Chalfie)和錢永健(Roger Tsien)
[3]。1962 年，下村修等分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素，并發(fā)現(xiàn)一種綠色的熒光蛋白。1974 年，他們分離得到了這個(gè)蛋白，當(dāng)時(shí)稱綠色蛋白，以后稱綠色熒光蛋白(GFP)
[4] 。1994 年，查爾菲等**在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)了能發(fā)射綠色熒光的GFP，開(kāi)創(chuàng)了GFP 研究與應(yīng)用之先河
[5]?！?
綠色熒光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP)是238 個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，其分子量為27 kDa。GFP 作為一種新的報(bào)告基因，與以往lacZ、CAT 等報(bào)告基因相比，有很多的性: GFP 不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達(dá)；熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性高；不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光,尤其適用于體內(nèi)的即時(shí)檢測(cè)；另外GFP 分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對(duì)受體無(wú)毒害,安全可靠；并且通過(guò)替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。正是由于GFP 檢測(cè)具有高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需使用同位素等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究**域
[ 6～7] 。采用GFP 作為標(biāo)記基因，可直接收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)，縮短了篩選時(shí)間、減少對(duì)細(xì)胞活性的影響并可作為活體標(biāo)記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機(jī)制提供了一種簡(jiǎn)潔有效的手段
[ 8、9 ] 。采用基因工程手段生產(chǎn)GFP 標(biāo)記的方法，可建立一種簡(jiǎn)便、快速的**診斷技術(shù)
[10] 。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌（
Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞是分子克隆的**步驟
[11]，是基因克隆以及DNA文庫(kù)構(gòu)建等研究中頻繁使用的一項(xiàng)重要的常規(guī)操作。一般實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有電穿孔技術(shù)所需要的特殊儀器，而利用氯化鈣法將質(zhì)粒重組入大腸桿菌細(xì)胞，操作方便、應(yīng)用廣泛.目前, 感受態(tài)細(xì)胞的制備主要采用CaCl
2 法， 該方法操作簡(jiǎn)單、容易掌握、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化率高， 可廣泛應(yīng)用于一般的實(shí)驗(yàn)室。其原理是Ca
2+ 破壞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)陣列，并與膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無(wú)機(jī)磷酸形成復(fù)合物以利于外源DNA 的滲入
[12]
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