国产三级在线观看播放,国产农村妇女精品一二区,国产精品久久久,国产肥熟女视频一区二区三区,国产成人精品亚洲777人妖

　　轉(zhuǎn)染操作流程：(貼壁細胞轉(zhuǎn)染方法)

　　1. 接種細胞： 轉(zhuǎn)染前一天，用膠原酶（BIOHUB Cat#78CL10002)消化細 胞并計數(shù)。調(diào)整細胞濃度，將細胞鋪入細胞培養(yǎng)的器皿，每個孔置 入的細胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時細胞匯合度達到 70~80%。

　　2. 準備 DNA-PEI 復(fù)合物： DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升 至室溫。依據(jù)表 1 所示，用 Opti-MEM ITM或其他適合的無蛋白培 養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋 PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 線 性 PEI 轉(zhuǎn)染試劑(這個需要客戶自行摸索配比，每一批轉(zhuǎn)染試劑和每一批 DNA 比例可 能會稍有不同）。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的線性 PEI 轉(zhuǎn)染 試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI 復(fù)合物。當溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 NEST 5 mL /14 mL 離心管。

　　3. 轉(zhuǎn)染細胞： 直接向每個孔中加入 DNA-PEI 復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在 無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴 DNA-PEI 復(fù)合 物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加?體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。

　　4. 孵育細胞和分析結(jié)果： 在 CO2 培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染 后最快 7 h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達。

　　5. 轉(zhuǎn)染 24 h 后，將細胞傳代至新鮮的生長培養(yǎng)基中（將細胞稀釋 10 倍 以上），在 CO2 培養(yǎng)箱中 37℃孵育過夜。第二天加入與轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的篩選藥物。約 1~2 周可 篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長培養(yǎng)基。

　　線性聚乙烯亞胺PEI MW25000 轉(zhuǎn)染操作流程：(懸浮細胞轉(zhuǎn)染方法)

　　1. 轉(zhuǎn)染前準備：懸浮細胞傳代接種于適量含懸浮細胞生長培養(yǎng)基中，合適條件下培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)瓶大小調(diào)整細胞密度（例100mL培養(yǎng)瓶，1X10 6 cells/mL），然后旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)，2~4小時后可以進行轉(zhuǎn)染。

　　2. 準備 DNA-PEI 復(fù)合物：DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室。用 Opti-MEM ITM或其他適合的無血清培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋 PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 線性PEI轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的線性PEI轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI復(fù)合物。當溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 NEST 5 mL /14 mL 離心管。

　　3. 轉(zhuǎn)染細胞：將PEI-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)液中，搖勻后旋緊瓶口放回搖床合適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至可以分析檢測。

　　4. 孵育細胞和分析結(jié)果：轉(zhuǎn)染后一般24-72h即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達。 請自行確定適合檢測時間。

　　5. 如果要獲得更多的蛋白產(chǎn)量，有文獻表明轉(zhuǎn)染后24小時，可以適當稀釋細胞，稀釋比例參考范圍（1:1—1:5）之間，可以增加蛋白產(chǎn)量，稀釋效應(yīng)與最佳稀釋比率應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗確定。